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SPR親和力測定

發(fā)表時間:2022-01-22 訪問次數(shù):5120

一、概述

  親和力是判定分子間相互作用的重要參數(shù),是了解分子以及藥物的發(fā)現(xiàn)與篩選等的重要指標。對于藥效的評價、生物大分子及其復合體的穩(wěn)定性的評估需要從動力學、熱力學和熱穩(wěn)定性等方面進行:包括分子間的結(jié)合、結(jié)合的快慢、結(jié)合的強弱、結(jié)合的機理等多方面的全面性研究。

  普健生物提供的表面等離子共振(Surface Plasmon Resonance, SPR)服務能夠?qū)崿F(xiàn)對蛋白,抗體、多肽、核酸及小分子化合物等相互作用的定性定量分析,也可以對細胞裂解液、文庫樣本等依托LSPR-Selex技術(shù)垂釣篩選未知靶標。

SPR親和力測定SPR親和力測定

 

SPR芯片工作原理示意圖

 

二、服務內(nèi)容

服務內(nèi)容 交付內(nèi)容

服務周期

樣本準備(可選) 蛋白/抗體/多肽/核酸/小分子等      /
親和力測定 親和力檢測報告;結(jié)合常數(shù)(Ka)、解離常數(shù)(Kd)、親和常數(shù)(KD);響應曲線;親和力強弱排序 2-3周

 

三、實驗流程

  1、按照 OpenSPRTM 儀器標準操作程序安裝 NTA 芯片。

  2、開始以最大流速(150 µL/min)運行,檢測緩沖液PBS(pH7.4)。

  3、達到信號基線后,調(diào)整緩沖液的流速到20 µL/min。

  4、開始激活芯片,取出制備好的咪唑和NiCl2 溶液,通過進樣口注入,與傳感器相互作用5min完成芯片表面功能化,準備配體。

  5、用激活緩沖液稀釋用于固定的配體, 體積為200µL濃度為10-50µg/mL ,通過進樣口注入相互作用4 min。

  6、觀察基線5 min,以確保穩(wěn)定。

  7、通過比較注入配體前后的信號測量配體結(jié)合的量。如果需要更多的配體,可以再次注入配體。

  8、配體信號穩(wěn)定之后,開始注入高濃度的分析物,以確認配體的活性,并確認表面大致的最大結(jié)合能力。

  9、將流速提高到150 µL/min,注入適當?shù)脑偕彌_液,以去除分析物。

  10、分析物用緩沖液稀釋,濃度詳見實驗結(jié)果,并以20 µL/min 上樣,蛋白與配體結(jié)合時間均為240 s;自然解離420 s。

  11、本次實驗結(jié)果所使用分析軟件為:TraceDrawer (Ridgeview Instruments ab, Sweden),分析方法是 One To One 分析模型。

四、結(jié)果分析

動力學及親和力參數(shù)

參數(shù)

釋義 結(jié)果
ka (1/(M*s)) 結(jié)合速率常數(shù) 2.82e5
kd (1/s) 解離速率常數(shù) 4.16e-4
KD (M) 解離平衡常數(shù),也叫親和力常數(shù) 1.48e-9
 

SPR親和力測定

  結(jié)果說明:靶蛋白跟 Gidn 的親和力為48 nM.

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